2008-05-16

1 实验目的
    重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白的体外抗肿瘤活性测定方法，是采用Daudi细胞和WST-1试剂盒。由于Daudi细胞内有EB病毒，有实验操作人员安全顾虑。另外WST-1是进口试剂盒，不是常规、国内外均认可的试剂盒，价格比较贵，方法稳定性差。因此试图建立国内外认可、方便和可靠的测定肿瘤细胞增殖活性方法，应该比较有意义。
磺酰罗丹明B (sulforhodamine B，SRB)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。可以与经三氯乙酸固定后的细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，显现一种明亮的粉红色，其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
本研究通过SRB法，观察Novaferon对人大肠癌细胞LS180的体外增殖抑制程度，并与IFNα-2b的活性比较，测定Novaferon的抑制肿瘤细胞增殖活性，并分析本方法作为活性测定方法的适用性。

2 实验材料
2.1细胞株
人结直肠癌细胞株LS180，培养液为高糖DMEM。
2.2 样品
（1）受试品
名    称：重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白（Novaferon）
提供单位：杰华生物技术（北京）有限公司
批    号：A20071201
纯    度：大于98%
比    活：3×10⁹ IU/mg
浓    度：1.1 mg/ml
稀 释 液：含10%血清的培养液
（2）对照品
名    称：IFNα-2b
提供单位：杰华生物技术（北京）有限公司
批    号：A20070913
浓    度：1.17mg/ml
纯    度：大于98%
稀 释 液：含10%血清的培养液
2.3 试剂
SRB（Sigma）、50%TCA，10mmol/l Tris(PH=10.5)，96孔板（Costar）。

3 实验方法
对数生长期的细胞消化后计数，调整细胞的密度为2×10⁴/ ml，按照100µl/孔加入96孔板中，37℃，5%CO₂培养过夜。加入不同浓度Novaferon、 IFNa-2b100µl/孔，Novaferon、 IFNa-2b的作用终浓度为100000、10000、1000、100、10、1、0.1、0.01 、0.001、0.0001 ng/ml，混匀，37℃，5%CO₂培养。6天后，加入预冷的50%TCA 50µl/孔，4℃固定1小时，弃固定液，去离子水洗5遍，空气干燥。每孔加入100µl SRB染色液，室温染色10分钟。弃染色液，用1%醋酸洗5遍，空气干燥，每孔加入150µl  10mmol/l Tris溶解SRB，酶标仪OD540读数。

4 实验结果与讨论
结果发现，Novaferon在1ng/ml以上浓度，其对肿瘤细胞的抑制率均接近70-80%，无明显差别，说明抑制作用接近饱和。随浓度降低，Novaferon抑制肿瘤细胞增殖活性下降,而对照品FN α-2b在100ng/ml以上浓度，其对肿瘤细胞的抑制作用较强，Novaferon对肿瘤细胞的抑制作用明显强于对照品IFN α-2b。对三批试验的结果拟合出IC₅₀并相比较，结果表明Novaferon的活性较对照品IFN α-2b强272、282、251倍，平均268倍（具体结果见后面的附件）。
 

在建立本试验方法过程中，针对LS180细胞株的生长特点和干扰素类药物的作用特点（以抑制增殖为主），对检测体系进行了摸索，包括接种细胞数量和培养时间等，相对而言，目前的实验方法比较适用，但也不排除通过进一步优化实验条件（选择更灵敏的肿瘤细胞株等），可增加实验的灵敏度。
 

体外抗肿瘤细胞活性测定方法比较多，主要有细胞直接计数法、³H-TdR掺入法、MTT法以及SRB法。直接计数法操作简便，但主观性较大，费力，目前已不多用；³H-TdR掺入法灵敏度较高，但需要特殊的仪器设备，还存在着同位素污染问题。MTT法简便、快速，研究结果稳定，重复性好，目前应用较多，但MTT法灵敏度稍差，OD值可随放置时间而变。
 

美国肿瘤研究所（National Caner Institute，NCI）的研究结果显示，SRB法比MTT比色法进行肿瘤药物敏感试验有一定优越性。有人1991年对SRB法与MTT法在不同的人类肿瘤细胞等对化疗药物敏感性方面进行了比较，认为SRB法比MTT法提供了更好的与细胞数量之间的线性关系和更高度的敏感性，细胞碎片不能被SR染色，因而药物敏感性也不受影响。进一步研究认为，SRB法比MTT法更灵敏，若一孔中仅有150个细胞，用SRB法可以检测出，而MTT法却测不出。国内用SRB显色法检测抗癌药物的敏感性，结果与国外报导相符,认为实验时间比MTT更短，样品易保存，操作简便，方法灵敏，数据客观，稳定性和重复性好，无同位素污染。

5  参考文献
[1] Rubinstein, LV, Shoemaker, RH, Paull, KD, et al. Comparison of in vitro anticancer drug screening data generated with a tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines. J. Nat. Cancer Inst. ,1990，82：1113-1118
[2] Srehan P, et al. New eolorimetric cytotoxicity assay for auticaneer-drug screening J of Nat Cancer Ins. 1990,82(13):1107-1112.
[3] Reepers et al. Comparison of the sulforhodamine B protein and tetragolium(MTT) assay for in vitro chemosensitivity testing Eur J cancer. 1991,27(7):897-900.
[4] Aaselsberger K et al. Assay of anticancer drugs in tissue culfure: comparison of a tetragolium-based assay and a protein binding dye assay in short-term cultures derived from human malignant glioma. J Anticancer drug. 1996,7(3):331-338.
[5] 王青素等。SRB显色法用于抗癌药物敏感性试验的研究。科技通报。2000，16（2）：104-107。