摘    要

    重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白（Novaferon）是采用基因穿梭法筛选获得、具有干扰素样活性、与人干扰素高度同源的新型重组蛋白质。本项目从体内外抗肿瘤效应、体外抗HIV、HBV和H5N1效应、抗血管新生、对正常猴骨髓细胞增殖的影响、食蟹猴初步毒性和免疫原性、抗肿瘤机制及对肿瘤细胞基因表达谱的作用等方面进行了系列研究，并与已上市的HuIFNα-2b（甘乐能）进行对比。结果如下：
1. 体外抗肿瘤实验结果表明：(1)乐复能对多数实体瘤细胞株有明显的增殖抑制作用，对黑色素瘤细胞和大肠癌细胞的抑制作用尤为显著；对B细胞淋巴瘤Daudi和Ramos细胞株的生长抑制作用极其显著，在1pg/ml浓度时其抑制率大于50%。（2）与HuIFNα-2b相比，乐复能对多数实体瘤细胞株的抑制效果更加明显，达到同样抑制效果的浓度低10-1000倍。（3）与常用的周期特异性化疗药物5-FU伍用，能显著增强乐复能的抑瘤作用，尤其是在5-FU作用2天时抑瘤作用非常显著，明显优于HuIFNα-2b，呈现协同效应。（4）乐复能与肿瘤细胞作用7天的结果显示：0.1ng/ml 乐复能的抑瘤率达80.5%，而相同浓度乐复能作用3天时的抑瘤率仅为10.5%。HuIFNα-2b在此浓度下作用7天的抑瘤率不及10％。
2. 体内抗肿瘤实验证实：乐复能对裸鼠接种前列腺癌细胞株（PC-3）、肝癌细胞株HepG2、结直肠癌细胞株LS180、人白血病细胞株HL-60（S）和黑色素瘤细胞株A357的生长有明显抑制作用，且呈剂量依赖关系。2.5×106 IU/kg或12.5µg/kg的乐复能对上述裸鼠移植瘤即有显著的抗肿瘤活性。同剂量乐复能的抗肿瘤效果明显优于对照品HuIFNα-2b。（见图 B-1、B-2）
3. 体外抗血管新生作用研究发现：乐复能对人脐带血管内皮细胞（HUVEC）生长有明显的抑制作用，且优于HuIFNα-2b；沙利度胺的作用较强，但有效剂量较大，仅在130µg/ml时作用较强，而65µg/ml时的作用弱于乐复能，与乐复能 1ng/ml时的作用相当；乐复能、HuIFNα-2b和目前公认的血管内皮抑制剂Endostatin均能抑制肿瘤细胞诱导的HUVEC的迁移，但以乐复能的作用最明显；乐复能和HuIFNα-2b均能抑制血管内皮细胞的小血管形成，而乐复能的作用更加显著。（见表B-1）

图 B-1. 荷瘤裸鼠体内治疗对照实验结果（PC-3细胞）

 图B-2. 乐复能对裸鼠体内PC-3细胞移植瘤的影响

模型对照组为空白对照组，受试品组为乐复能治疗组。图中可见，经过30天的乐复能治疗，无论是高剂量组还是低剂量组，裸鼠体内的肿瘤均小于对照组，高剂量组抑瘤效果尤为明显。由此可见，乐复能对接种到裸鼠体内的前列腺癌细胞株（PC-3）有强烈的抑制作用。
表B-1 乐复能对血管内皮细胞小血管形成的影响
药物                 浓度（ng/ml）          面积（μm2）
细胞对照             - 1440.14               ±967.13
乐复能                2 1463.92                 ±879.78
乐复能                20 1215.24               ±674.81
乐复能                200  897.77              ±445.24 *
甘乐能                2 1247.67                ±615.30
甘乐能                20 1266.98              ±640.75
甘乐能                200 1163.61              ±472.31
* 乐复能对血管内皮细胞小血管形成的抑制作用最为明显（P<0.05）.

4. 抗肿瘤作用机制研究结果显示：乐复能可通过调节细胞周期使肿瘤细胞停滞在S期，并诱导肿瘤细胞凋亡，发挥显著的抗肿瘤作用。此效能明显优于HuIFNα-2b。乐复能激活干扰素信号通路的活性明显高于HuIFNα-2b。以HT-29为细胞模型，利用免疫荧光标记和流式细胞仪观察乐复能对肿瘤干细胞标志物CD133表达的影响，结果提示乐复能能明显抑制肿瘤干细胞。
5. 基因表达谱研究结果显示：HuIFNα-2b对肿瘤基用芯片85条肿瘤相关基因表达有明显的诱导作用，对109条基因表达有明显的抑制作用。同剂量的乐复能对175条肿瘤相关基因表达有明显的诱导作用，对306条基因表达有明显的抑制作用。乐复能与HuIFNα-2b 对肿瘤细胞基因表达的影响，无论数量还是表达变化水平均有明显差异。HuIFNα-2b与乐复能对部分已知干扰素靶基因有调节作用，但诱导表达水平不同。HuINF α-2b对部分与肿瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡、免疫和抗病毒相关的基因无抑制或诱导作用。经乐复能处理后，肿瘤细胞的CRK、HRAS（原癌基因）、BCR等表达明显降低，细胞增殖明显受到抑制；TNFSF10表达增加，选择性诱导肿瘤细胞凋亡；抗病毒相关基因表达增多。此结果提示：在基因水平上乐复能具有与 HuIFNα-2b相似的作用，但明显优于后者。
6. 抗乙型肝炎病毒研究发现：高、中、低浓度的乐复能都有降低HepG2.2.15细胞和上清中HBV DNA拷贝数的作用，并呈剂量依赖关系。HuIFNα-2b高浓度有效，低浓度无抑制作用。乐复能的作用优于野生型IFN α-2b，即乐复能有显著抑制HBV DNA复制的活性。
7. 抗禽流感病毒研究显示：乐复能对H5N1病毒有一定的抑制作用，在浓度为1ng/ml时对H5N1病毒的抑制率达50%以上。HuINFα－2b对H5N1病毒也有轻度的抑制作用，效果弱于乐复能。盐酸金刚烷胺对H5N1病毒的抑制率较弱，达菲对H5N1病毒的抑制作用不明显。
8. 抗HIV病毒研究显示：乐复能和HuIFNα-2b对MT4细胞均有弱的细胞毒活性，两者之间无明显差异。乐复能能明显减少病毒（HIV-1 ⅢB株）细胞病变孔，降低培养上清的P24水平。乐复能具有显著的抗HIV-1活性，且明显优于HuIFNα-2b。
9. 对骨髓细胞的毒性研究表明：乐复能对正常猴骨髓细胞有轻度的抑制作用，与阳性对照品HuIFNα-2b的作用相当，两者之间无明显差别，表明虽然乐复能的生物活性显著提高，但对骨髓的抑制作用并未随之增强。
10. 食蟹猴皮下注射乐复能的初步毒性和免疫原性研究结果显示：给药后1周外周血白细胞数下降。随着给药时间的延长，未见白细胞数进一步降低。其余指标未见明显变化。抗体检测结果显示，注射乐复能可在动物体内产生抗体。连续给药4周后，乐复能诱导猴抗体产生，但外周血白细胞数仍维持稍低水平，而HuIFNα-2b组动物的外周血白细胞数已恢复，初步提示HuIFNα-2b的抗体具中和活性，而乐复能诱导产生的抗体无明显中和活性。

综上所述，乐复能在体内外均具有显著的抗肿瘤活性，效果明显优于HuIFNα-2b。乐复能具有体外抗HBV、HIV和H5N1等病毒的活性，此作用明显强于HuIFNα-2b。乐复能具有超强、广谱的抗病毒和多作用机制的抗肿瘤活性，但骨髓抑制作用并不随之增加。因此，乐复能有望成为具有显著抗肿瘤、抗病毒潜能的生物技术新药。

　研究单位：军事医学科学院